甘蔗环斑病菌鉴定其生物学特性分析,本论文为您写生物学特性毕业论文范文和职称论文提供相关论文参考文献，可免费下载。
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摘 要 甘蔗环斑病是甘蔗较为常见的一种真菌性病害.针对海南昌江十月田甘蔗种植地出现一种严重危害疑似环斑病的叶斑病,本文通过对其病原菌的形态学特征观察,并结合ITS序列系统聚类分析,将叶斑病病菌鉴定为引起环斑病的甘蔗小球腔菌Leptosphaeria sacchari.生物学特性分析结果表明：适宜该菌生长的温度为13～30 ℃,最适温度为 25 ℃；适宜菌丝体生长的pH为4～11,最适pH为5,全黑暗有利于菌丝体的生长；适宜生长的碳源为麦芽糖和葡萄糖、氮源为硝酸钠和L-丝氨酸.采用生长速率法对6种杀菌剂敏感性进行了测定,结果揭示咪鲜胺、丙环唑、多菌灵、腈菌唑等4种药剂对甘蔗环斑病菌具有显著的抑制效果,其EC50值分别为0.397 6、2.251 9、2.163 4、4.827 3 μg/mL.
关键词 甘蔗环斑病；小球腔菌；生物学特性
中图分类号 S435.661 文献标识码 A
甘蔗环斑病（Sugarcane ring spot）又名轮斑病,是甘蔗上较常见的一种真菌性病害.自1890年印度尼西亚爪哇首次报道该病以来,迄今几乎所有植蔗国家都有发生.此病多危害糖蔗老叶,当条件适宜时,也可为害叶鞘和蔗茎.严重时,该病使叶片提早枯死,直接影响甘蔗的产量和含糖量.此外,环斑病也能危害果蔗,且该病在果蔗上具有感病快、传染快,连作地易发病等特点[1].目前该病在中国蔗区普遍发生[2-8].然而,针对此病的相关研究比较少.目前关于甘蔗环斑病的研究仅限于病害调查及大田防控试验.贵州果蔗病害重灾区的调查结果表明,环斑病是危害果蔗的主要病害之一,该病可导致果蔗的產量和品质受到严重影响[9]；李向勇和易代勇则对黔糖3号环斑病作了田间药效防控试验[9].
2015年7月本课题组在对海南甘蔗种植区进行病害调查时发现,海南昌江十月田甘蔗种植地出现一种疑似甘蔗环斑病的叶斑病,严重影响其甘蔗产量.为了明确其病原菌,以及掌握该病的发生和流行条件,本研究对采集的典型病样进行了分离和鉴定,并进一步对其生物学特性分析和防治药剂的筛选,以期为掌握该病的病菌流行规律以及预测预报奠定基础.
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 供试样品 病叶样品采自海南昌江十月田甘蔗种植地.
1.1.2 供试培养基 供试马铃薯葡萄糖（Potato Dextrose Agar,PDA）培养基按如下配方进行配制：马铃薯200 g、葡萄糖16 g、琼脂粉20 g、蒸馏水定容至1 000 mL；而Czapek基础培养基配制为：硝酸钠2.00 g、磷酸二氢钾1.00 g、氯化钾0.50 g、七水硫酸镁0.50 g、硫酸铁0.01 g、蔗糖30.00 g、琼脂粉20 g、蒸馏水定容至1 000 mL.上述培养基均于121 ℃高压灭菌20 min后备用.
1.1.3 试剂、引物及菌株 真菌DNA小量提取试剂盒购自OMEGA公司.rDNA-ITS通用引物ITS1/ ITS4序列[10],由英潍捷基（上海）贸易有限公司采用普通脱盐方式合成；大肠杆菌Trans-T1感受态细胞由北京全式金生物技术有限公司提供,其它试剂均为国产分析纯.
1.2 方法
1.2.1 病原菌的分离和形态观察 利用常规组织分离法,对具有典型症状的甘蔗叶片进行病原菌分离培养.记录病原菌在PDA培养基上的菌落形态和菌丝体颜色,并于显微镜下对分生孢子器及分生孢子的形态、颜色、大小等进行观察.
1.2.2 病原菌致病性测定 利用柯赫氏法对分离物进行致病性测定.将分离物在PDA培养基上预培养6 d左右.采用菌饼法,利用健康新台糖22号甘蔗离体叶片接种,保湿,5 d后观察其是否发病,并从病部对病原菌进行再分离,观察所分离物是否和原分离物的形态特征一致.
1.2.3 基于r DNA-ITS 区序列的病原菌分子鉴定
病原菌基因组总DNA的提取参照OMEGA真菌DNA小量提取说明书进行提取.利用引物ITS1/ ITS4对病原菌基因组总DNA为模板进行PCR扩增.PCR产物回收采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（TaKaRa）,按试剂盒说明书进行操作.取4 μL回收产物和pEASYTM Cloning Vector连接,转化大肠杆菌感受态细胞,经蓝白斑筛选后,选取3个阳性克隆子送英潍捷基（广州）贸易有限公司测序.
1.2.4 rDNA-ITS序列比对分析 将测序得到的rDNA-ITS序列经两端去载体序列后,于GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行BLAST比对及同源序列分析,并利用MEGA 4.0软件中邻接法 （neighbor-joining,NJ）进行聚类分析,绘制出相应的系统发育树.
1.2.5 病原菌生物学特性分析
（1）不同温度下菌落生长速率测定.以马铃薯葡萄糖培养基为基础培养基,接种菌丝块（5 mm,下同）,分别于5、13、20、25、28、30、37 ℃等7个梯度温度培养.培养6 d后,用十字交叉法测量菌落直径.重复3次,下同.
（2）不同酸碱度下菌落生长速率测定.以1为梯度,分别将已灭菌的培养基调节为pH4.0至pH11,迅速倒制平板.冷却后,接种菌丝块,25 ℃恒温培养箱中培养,6 d后测量菌落直径（重复3次；下同）.
（3）光照对菌落生长的影响.将直径为5 mm的菌丝块接种于PDA平板,分别置于全日光照、12 h光照/12 h黑暗、全日黑暗等3种条件下培养.
（4）不同碳源对病原菌生长的影响.以固体Czapek培养基为基础,分别以等量的蔗糖（20 g）、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、D-木糖、和D-半乳糖作为碳源,配制成不同碳素营养的培养基.接种菌丝块,25 ℃恒温培养箱中培养,6 d后测量菌落直径.
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